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Servicio de Clasificación Celular y Citometría de Flujo

(SECIF-IIBCE)

 

Perfil

 

El Servicio de Clasificación Celular y Citometría de Flujo (SECIF) constituye una plataforma tecnológica de apoyo a investigadores en áreas básicas o aplicadas, instituciones o empresas del ámbito público o privado que requieran estudios de poblaciones de células o partículas subcelulares a alta velocidad. Posee equipos de alta performance para estudios citométricos de poblaciones linfocitarias, diversos análisis multiparamétricos de células animales o vegetales, clasificación celular o cromosómica y deposición de células en diferentes sustratos. Este servicio desarrolla actualmente numerosos proyectos de investigación en colaboración con instituciones vinculadas al sector productivo de nuestro país y la región. El SECIF lleva a cabo sus actividades en coordinación con los servicios citométricos del Instituto Pasteur de Montevideo (IPMONT), bajo la forma de una Plataforma Conjunta de investigación y desarrollo.

 

Integrantes

Dr. Gustavo A. Folle

Profesor Titular de Investigación.

gfolle@iibce.edu.uy

Ing. Agr. Beatriz López-Carro

Técnico Especializado en Citometría de Plantas.

blopez@iibce.edu.uy

Mag. Federico Santiñaque

Técnico Especializado en Citometría de flujo y Clasificación celular.

fsantinaque@iibce.edu.uy

Dra. Rosana Rodríguez-Casuriaga

Investigadora asociada. Especialista en el análisis de células meióticas.

rrodriguez@iibce.edu.uy

Contactos:

Gustavo Folle
Mail: gfolle@iibce.edu.uy

Federico Santiñaque
Mail: fsantinaque@iibce.edu.uy

Teléfono: (598) 24871616 int. 218

 

¿Qué es la citometría de Flujo?

Durante el siglo IX y primera mitad del siglo XX, el estudio de la estructura de las células tanto animales como vegetales se basó fundamentalmente en el uso del microscopio óptico. El avance en el conocimiento de la estructura celular ha estado frecuentemente precedido por desarrollos técnicos de este instrumento. La asociación entre microscopios y computadoras ha permitido aumentar considerablemente la capacidad de análisis de células y tejidos. El microscopio electrónico, que permite estudios a gran aumento, ha aportado valiosa información sobre las estructuras celulares. Hoy en día es posible realizar estudios tridimensionales de las células (algo similar a una tomografía celular) empleando el denominado microscopio confocal.


Aún empleando los sistemas microscópicos más modernos, el número de células que pueden ser analizadas en un determinado período de tiempo es siempre limitado. Por otro lado, con frecuencia es necesario analizar no solamente un pequeño número de células, sino verdaderas poblaciones celulares que incluyen por lo menos varios miles de estos elementos. El estudio de poblaciones celulares es fundamental tanto en investigaciones básicas como en estudios aplicados (por ejemplo diagnóstico y clasificación de leucemias y linfomas). No es posible alcanzar este objetivo empleando microscopios ópticos o electrónicos. Con ese fin, se han desarrollado otro tipo de instrumentos denominados citómetros de flujo (citómetro: aparato que mide células). En este caso, las células no están adheridas a un portaobjetos como en los estudios microscópicos convencionales sino que transcurren en una corriente líquida (flujo). Este hecho posibilita que pueda acelerarse de manera considerable la velocidad de análisis de las mismas.


Un citómetro de flujo es un instrumento complejo ya que combina avanzados conocimientos de dinámica de fluídos (que permite alinear las células en la columna líquida para su análisis), iluminación LASER, óptica (que permite obtener y recoger la información celular) y de procesamiento electrónico y computacional de las señales celulares. La integración de todos estos elementos torna a los citómetros de flujo (al menos los de mayor complejidad) en instrumentos de elevado costo. El principio en que se basan estos instrumentos es lograr alinear las células en una columna líquida muy fina (menos de una décima de milímetro de diámetro) para que sean iluminadas por un haz muy potente de luz LASER. De la interacción LASER-célula surgen señales luminosas que son recogidas por detectores muy sensibles (denominados fotomultiplicadores) que luego son amplificadas y analizadas por sofisticados programas de computación.


Qué datos podemos obtener de las células utilizando un citómetro de flujo? A qué velocidad?


La iluminación de las células con luz LASER nos permite conocer el tamaño y la complejidad de los diferentes tipos de células. Si agregamos el uso de moléculas fluorescentes para marcar estructuras celulares (por ej. ácido desoxirribonucleico o ADN, ácido ribonucleico o ARN, antígenos, etc.) se amplía enormemente sus posibilidades de detección. Dichas sustancias fluorescentes, al ser iluminadas por la luz LASER, emiten señales lumínicas en diferentes longitudes de onda (que son captadas por diferentes detectores) con lo cual podemos obtener valiosa información de las propiedades de una población celular. En un citómetro convencional logramos información sobre al menos 5 parámetros (por ejemplo tamaño, complejidad, contenido de ADN, viabilidad celular y presencia o ausencia de antígenos). Lo interesante de esta metodología es que no sólo aporta muchos datos en forma simultánea, sino que lo realiza a velocidades que parecen asombrosas porque es capaz de analizar al menos 100.000 células en solamente un segundo!


Los citómetros de flujo de mayor complejidad son también capaces de clasificar a las células que resulten de interés para el investigador. Entendemos por clasificar la posibilidad de separar del resto a un conjunto de células que comparten una o varias propiedades y recolectarlas en un tubo, placa de cultivo o portaobjeto. Esto permite llevar a cabo estudios más sofisticados de una población de células similares, iniciar cultivos de un mismo tipo celular, etc. Para dar una idea de la especificidad del mecanismo de separación de los citómetros de flujo cabe mencionar que se emplean para separar los distintos tipos de cromosomas de la especie humana u otras especies. La obtención de suspensiones cromosómicas de elevada pureza mediante citometría de flujo ha permitido formidables avances en el conocimiento del genoma humano y en la obtención de sondas moleculares aplicables a diagnóstico citogenético de diversas patologías.


Explicar en detalle el mecanismo que se utiliza para clasificar los diferentes tipos de células o cromosomas excede los objetivos de esta introducción. Basta mencionar que para lograrlo se fragmenta la columna líquida en pequeñas gotas haciendo vibrar la boquilla hasta 100.000 veces por segundo!. Luego de ajustes apropiados, se logra que las células o partículas subcelulares se incorporen a las gotas generadas. Cuando el citómetro detecta una célula o cromosoma de interés para clasificar, el aparato carga eléctricamente la columna liquida de forma tal que sólo la gota que contiene el evento de interés (célula) queda cargada. Finalmente, el sistema direcciona dicha gota con la célula hacia un tubo recolector al ser desviada por un intenso campo eléctrico.


Qué aplicaciones tienen los citómetros de flujo en la investigación básica y aplicada?


El campo de aplicación de este tipo de instrumentos crece rápidamente día a día ya que son numerosas las áreas de la biología y medicina que se benefician de su uso. Entre otras aplicaciones, se encuentra la tipificación de las leucemias y los linfomas que permite alcanzar un diagnóstico preciso, permitiendo un tratamiento y seguimiento más adecuado y eficaz. Otra aplicación muy importante es el estudio de las poblaciones linfocitarias afectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) causante del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) que permite conocer en los individuos afectados su capacidad de respuesta inmunitaria, de capital importancia para el seguimiento de la evolución de la infección y el tratamiento adecuado para el paciente.


El estudio de la cantidad de material hereditario (ADN) posee numerosas aplicaciones. En medicina, se emplea para evaluar si existen cambios genéticos en poblaciones de células tumorales. La presencia de estos cambios tiene importancia en el prónostico de la enfermedad maligna. Dado el elevado número de células a analizar para realizar estos diagnósticos, el citómetro de flujo es la herramienta indicada para este tipo de estudios. También es posible estimar si las células han sufrido cambios relevantes en el ADN, así como evaluar su nivel de proliferación ya que con frecuencia las células malignas crecen con mayor rapidez que las normales. El citómetro es capaz de cuantificar el grado de proliferación celular, es decir la tasa con que las células se multiplican. En el campo de la biología, la citometría de flujo se ha tornado el método más empleado para determinar el contenido exacto de ADN de cada especie, lo cuál es de suma importancia para estudios genéticos, evolutivos y biotecnológicos. A su vez, se pueden realizar estudios del nivel de ploidia, análisis cromosómicos y estudios del daño del ADN.


En el reino vegetal, la aplicación de la CF constituye una herramienta fundamental en el desarrollo de programas de mejoramiento genético, biotecnologías, caracterización de recursos fitogenéticos y análisis de calidad genética de semillas. Es indudable que aun pequeños avances en estas investigaciones repercuten fuertemente en el sector agroindustrial y en la calidad de sus productos.

 

Servicios citométricos ofrecidos por SECIF

- Determinación del contenido de ADN en células animales y vegetales
- Determinación de niveles de ploidía en híbridos en plantas
- Cuantificación del porcentaje de poliploidía en lotes de semillas forrajeras
- Análisis del ciclo celular
- Análisis de viabilidad celular, necrosis y apoptosis (contenido de ADN, Anexina V-FITC, TUNEL)
- Estudio y cuantificación de bacterias
- Análisis de poblaciones de plancton
- Separación y deposición celular a alta velocidad (hasta 70.000 eventos/seg)
- Análisis y separación de partículas a escala nanométrica (> 160 nm)
- Análisis en simultáneo de poblaciones complejas con amplio rango dinámico (160 nm - 30 micras)

Servicios actuales a instituciones o empresas

INASE

“Cuantificación de porcentaje de poliploidía en lotes de semillas de raigrás.” Responsables por INASE: Jorge Machado y Deneb Manfrini. Investigadores del SECIF: Federico Santiñaque, Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle. (Ver Folleto). (2007-2008)


Convenios interinstitucionales

Convenio de Plataforma Conjunta con el Instituto Pasteur de Montevideo en Citometría de Flujo y Clasificación Celular. (2007)

 

Publicaciones SECIF-IIBCE (2007-2018)

(Se indican en negrita los investigadores de SECIF)

Artículos originales

Gaiero P, Šimková H, Vrána J, Santiñaque FF, López-Carro B, Folle GA, van de Belt J, Peters SA, Doležel J, de Jong H (2018) Intact DNA purified from flow-sorted nuclei unlocks the potential of next-generation genome mapping and assembly in Solanum species. MethodsX 5:328-336.

Geisinger A, Rodríguez-Casuriaga R (2017) Flow cytometry for the isolation and characterization of rodent meiocytes. Methods in Molecular Biology, Special Edition on Meiosis 1471: 217-230.                doi: 10.1007/978-1-4939-6340-9-11

González AC, Vaio M, Porro V, Folle GA, Mazzella C (2017) Chromosome numbers, DNA content, morphological data, and nrITS sequence analyses in some species of Nassella (Trin.) E. Desv. and related genera (Stipeae, Poaceae). Brazilian Journal of Botany 40(1): 341-352.           doi : 10.1007/s40415-016-0337-0

Castillo A, Gaiero P, López-Carro B, Vilaró F (2016) Gametic embryonic response in wild diploid Solanum species and its implications for genome sequencing projects and breeding. Plant Tissue Culture and Biotechnology 26(2): 175-189.

Bauk K, Santiñaque FF, López-Carro B, LasPeñas ML (2016) ADN y patrón de genes ribosomales en el género monotípico Stetsonia (Cactaceae). Bol Soc Argent Bot. 51: 323-330.

da Cruz I, Rodríguez-Casuriaga R, Santiñaque FF, Farías J, Curti G, Capoano CA, Folle GA, Benavente R, Sotelo-Silveira JR, Geisinger A (2016) Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics 17:294. doi: 10.1186/s12864-016-2618-1

García EP, Tiscornia I, Libisch G, Trajtenberg F, Bollati-Fogolín M, Rodríguez E, Noya V, Chiale C, Brossard N, Robello C, Santiñaque FF, Folle GA, Osinaga E, Freire T (2016) MUC5B silencing reduces chemo-resistance of MCF-7 breast tumor cells and impairs maturation of dendritic cells. International Journal of Oncology 48(5): 2113-2123.

Paviolo NS, Santiñaque FF, Castrogiovanni DC, Folle GA, Bolzán AD (2015) The methylating agent streptozotocin induces persistent telomere dysfunction in mammalian cells. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen 794:17-24.

Goldman A, Rodríguez-Casuriaga R, González-López E, Capoano CA, Santiñaque FF, Geisinger A (2015). MTCH2 is differentially expressed in rat testis and mainly related to apoptosis of spermatocytes. Cell and Tissue Research 361: 869-883.

Romanelli G, Olivera-Bravo S, Santiñaque FF, Soto E, Javiel G, López-Carro B, Folle GA, Mimbacas A (2015) P-Selectin as a platelet activation marker and cardiovascular risk prediction factor. Differences between its two isoforms using flow cytometry and Elisa analyses. J J Hematology 1: 017.

Rodríguez-Casuriaga R, Santiñaque FF, Folle GA, Souza E, López-Carro B, Geisinger A (2014) Rapid preparation of rodent testicular cells suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. Methods X 1: e239-e243.

Geisinger A, Rodríguez-Casuriaga R, Santiñaque FF, Folle GA (2014) Revisiting testicular cell suspensions and meiocytes sorting (Commentary). Cytometry 85: 989-990

Las Peñas ML, Urdampilleta JD, López-Carro B, Santiñaque FF, Kiesling R, Bernardello G (2014) Classical and molecular cytogenetics and DNA content in Maihuenia and Pereskia (Cactaceae). Plant Systematics and Evolution 300: 549-558.

García G, Gutiérrez V, Ríos N, Turner B, Santiñaque F, López-Carro B, Folle G (2014) Burst speciation processes and genomic expansion in the neotropical annual killifish genus Austrolebias (Cyprinodontiformes, Rivulidae). Genetica 142: 87-98.

Rodríguez-Casuriaga R, Folle GA, Santiñaque FF, López-Carro B, Geisinger A (2013) Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions. Journal of Visualized Experiments (JoVE) e50102.  doi:10.3791/50102.

Chiarini F, Santiñaque FF, Urdampilleta J, Las Peñas ML (2013). Genome size and karyotype diversity in Solanum sect. Acanthophora (Solanaceae). Plant Systematics and Evolution 300: 113-125.

Reyno R, Narancio R, Speranza P, Do Canto J, López-Carro B, Burgueño J, Real D, Dalla Rizza M (2012) Molecular and cytogenetic characterization of a collection of bahiagrass (Paspalum notattum Flügge) native to Uruguay. Genetic Resources and Crop Evolution 59: 1823-1832.

Gaiero P, Mazzella C, Vaio M, Barros e Silva A, Santiñaque FF, López-Carro B, Folle G , Guerra M (2012) An unusually high heterochromatin content and large genome size in the palm tree Trithrinax campestris (Arecaceae). Australian Journal of Botany 60: 378-382.

Castillo A, Rebuffo M, Dalla Rizza M, Folle GA, Santiñaque FF, Borsani O, Monza J (2012) Generation and characterization of inter-specific hybrids of Lotus uliginosus x L. corniculatus. Crop Science 52: 1-11.

Scaldaferro M, Chiarini F, Santiñaque FF, Bernardello G, Moscone E (2012) Geographical pattern and ploidy levels of the weed Solanum elaeagnifolium (Solanaceae) from Argentina. Genetic Resources and Crop Evolution 59: 1833-1847

Rodríguez-Casuriaga R (2012) El cobayo como modelo de estudio de la gametogénesis masculina: análisis de sus peculiaridades y desarrollo de nuevos abordajes metodológicos. Libro integral. Editorial Académica Española, Lambert Academic Publishing GmbH & Co, KG, Saarbrücken, pp161.

Rehermann MI, Santiñaque FF, López-Carro B, Russo RE, Trujillo-Cenóz O (2011) Cell proliferation and cytoarchitectural remodeling during spinal cord reconnection in the fresh-water turtle Trachemis dorbignyi. Cell Tissue Research 344: 415-433.

Rodríguez-Casuriaga R, Geisinger A, Santiñaque FF, López-Carro B, Folle GA (2011) High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry Part A 79:625-634.

Geisinger A, Rodríguez-Casuriaga R (2010). Flow cytometry for gene expression studies of mammalian spermatogenesis”. Cytogen. Genome Res 128: 46-56.

Mazzella C, Rodríguez M, Vaio M, Gaiero P, López-Carro B, Santiñaque FF, Folle G, Guerra, M (2010) Karyological features of Achyrocline (Asteraceae, Gnaphalieae): stable karyotypes, low DNA content variation and rRNA genes linkage. Cytogenetic and Genome Research 128:169-176.

Rodríguez-Casuriaga R, Geisinger A, López-Carro B, Porro V, Wettstein R, Folle GA (2009) Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells by flow cytometric analyses. Biological Procedures Online 10: 113-120. DOI 10.1007/s12575-009-9003-2.

Dalla Rizza M, Real D, Reyno R, Porro V, Errico E, Quesenberry KH (2007) Genetic diversity and DNA content of three South American and three Eurasiatic Trifolium species. Genetics and Molecular Biology 30: 1118-1124.

Vaio M, Mazzella C, Porro V, Speranza P, López-Carro B, Estramil E, Folle GA (2007) Nuclear DNA content in allopolyploid species and synthetic hybrids in the grass genus Paspalum. Plant Systematics and Evolution 265: 109-121

Divulgación

Santiñaque FF, López-Carro B, Folle GA (2009) Un aporte a la selección de semillas. Almanaque del Banco de Seguros del Estado pp 214-216.

 

 

Proyectos del Servicio de Clasificación Celular y Citometría de Flujo (SECIF-IIBCE)

 

Incorporación de equipamiento científico

 

2017     Incorporación de un Citómetro de Flujo y Clasificador Celular MoFlo Astrios EQ a través del proyecto (PEC_1_2016_1_133123) presentado al Llamado a Grandes Equipos Científicos (2016) de la Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANNI) en conjunto con el IIBCE y la colaboración del Programa de Desarrollo en Ciencias Básicas (PEDECIBA). Costos total: U$S 560.000

 

Proyectos de investigación conjuntos de SECIF

 

Facultad de Agronomía

2002- 04     "Estudios Genéticos en Paspalum dilatatum común (forrajera nativa), arquitectura de los genomios I J X e identificación de patrones de restricción genomio específicos”. CSIC, I+D. Responsable: Dra. Cristina Mazzella. Laboratorio de Genética, Facultad de Agronomía y SECIF-IIBCE.
                     Investigadores del SECIF: Valentina Porro, Magdalena Vaio, Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle.

2005-07      "Estudios genéticos en dos géneros de gramíneas forrajeras nativas: Stipa y Paspalum (Gramineae)". CSIC, I+D. Responsable: Dra. Cristina Mazzella. Laboratorio de Genética, Facultad de Agronomía y SECIF-IIBCE.
                     Investigadores del SECIF: Valentina Porro, Magdalena Vaio, Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle (ver Apéndice 1).

2005-07      "Estudios citogeográficos de la especie Paspalum quadrifarium Lam. (Gramineae, Panicoidea)". Iniciación a la Investigación CSIC. Responsable: Mag. Magdalena Vaio. Laboratorio de Genética, Facultad de Agronomía y SECIF-IIBCE.
                     Investigadores del SECIF: Valentina Porro, Magdalena Vaio, Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle.

2008-10      "Determinación taxonómica y variabilidad genética en especies de “carquejas” (Baccharis; Asteraceae) y “marcelas” (Achyrocline; Asteraceae) usadas como plantas medicinales en Uruguay". CSIC, I+D. Responsable: Dra. Cristina Mazzella. Laboratorio de Genética, Facultad de Agronomía y SECIF-IIBCE.
                     Investigadores del SECIF: Federico Santiñaque, Magdalena Vaio, Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle.

2007-08      "Determinación y variabilidad genética en especies de carquejas (Baccharis; Asteraceae) usadas en Uruguay". PDT convocatoria Nº63/201. Jóvenes Investigadores. Responsable: Mag. Magdalena Vaio. Laboratorio de Genética, Facultad de Agronomía y SECIF-IIBCE.
                     Investigadores del SECIF: Federico Santiñaque, Magdalena Vaio, Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle.

2007-08      "Análisis genómico y contenido de ADN en todas las especies de palmas del Uruguay y un híbrido intergenérico". Iniciación a la Investigación CSIC. Responsable: Paola Gaiero.  Laboratorio de Genética, Facultad de Agronomía y SECIF-IIBCE.
                     Investigadores del SECIF: Federico Santiñaque, Magdalena Vaio, Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle.

2007-08      "Identificación de híbridos entre dos especies de Lotus". Responsable: Dr. Jorge Monza. Laboratorio de Bioquímica y SECIF-IIBCE. Investigadores del SECIF: Federico Santiñaque, Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle.

2009-10      "Estudios citogenético-moleculares y de contenido de ADN en Oxalis". Responsable: Magdalena Vaio. Investigadores del SECIF: Beatriz López-Carro, Federico Santiñaque y Gustavo A. Folle.

2009-11      "Hacia la caracterización de la estructura del genoma de la especie frutal nativa Acca sellowiana (Berg.) Burret: Abordajes genéticos, citológicos y moleculares". Financiado por CSIC I+D. Responsable: Clara Pritsch. Investigadores del SECIF: Beatriz López-Carro, Federico Santiñaque y Gustavo A. Folle.

 

INIA Las Brujas

2006-07      "Enfoque pluridisciplinar en mejoramiento, caracterización y valoración de forrajeras nativas". Responsable: Dr. Marco Dalla Rizza. INIA Las Brujas y SECIF-IIBCE. Investigadores del SECIF: Valentina Porro, Federico Santiñaque, Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle.


INASE

2006-08      "Desarrollo de un método para cuantificar porcentaje de poliploidía en lotes de semillas de raigrás". Responsables: Ings. Agrs. Jorge Machado y Deneb Manfrini. Laboratorio de Semillas, INASE y SECIF-IIBCE. Investigadores del SECIF: Federico Santiñaque, Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle.

 

Facultad de Ciencias

2005-06     "Análisis de la fracción picofitoplanctónica en una serie de lagunas costeras de interés múltiple". Investigadores Responsables: Sylvia Bonilla y Leticia Vidal, Sección Limnología. Investigador del SECIF:          Wilner Martínez.

2008-09     "Determinación de niveles de ploidía en mutantes de caspasas de Physcomitrella patens".Investigador Responsable:Marcel Bentancor Laboratorio de Biología Molecular Vegetal, Facultad de Ciencias. Investigadores del SECIF: Federico Santiñaque, Beatriz López-Carro.

 

IIBCE

2006-08      "Estudio de la espermatogénesis de Cavia porcellus mediante citometría de flujo". Proyecto de Doctorado de la Mag. Rosana Rodríguez-Casuriaga. Investigadores del SECIF: Beatriz López-Carro, Gustavo A. Folle, Valentina Porro y Federico Santiñaque.

2007-08      "Análisis de las posibles formas de acción del cobre en el control del cancro cítrico causado por Xanthomonas axonopodis pv. citri". Financiado por FPTA-INIA. Responsable: Dra. Mercedes Peyrou. Depto. de Biología Molecular y SECIF-IIBCE.
Investigadores del SECIF: Valentina Porro, Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle.

2008-09       "Estudios de proliferación celular en médula espinal lesionada de la tortuga Tracheemis dorbinii". Financiado por NIH (EEUU). En colaboración con el Departamento de Neurofisiología Celular y Molecular (IIBCE). Responsable: Raúl Russo. Investigadores del SECIF: F. Santiñaque y B.López-Carro.

2009-10     "Nueva metodología en el país para el estudio de la reactividad plaquetaria en pacientes diabéticos mediante citometría de flujo". Investigador Responsable: Dra. Adriana Mimbacas. Financiado por Laboratorios Roemmers. Investigadores del SECIF: Gustavo A. Folle, Beatriz López-Carro, Federico Santiñaque.

2008-10     "Estudio multiparamétrico de tumores de mama mediante citometría de flujo" Financiado por la Comisión Honoraria de la Lucha Contra el Cáncer (CHLCC). En colaboración con Departamento de Anatomía Patológica del Centro Hospitalario Pereira Rossell (CHPR). Responsable: Valentina Porro. Investigadores del SECIF: B. López-Carro y G. Folle.

2009-10     “Optimización de un método para cuantificar niveles de ploidía en lotes de semillas de Lotus uliginosus por citometría de flujo. Financiado por ANII Iniciación a la Investigación. Responsable: Federico Santiñaque. Investigadores del SECIF: Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle.

2009-12     “Nuclear Architecture, chromatin organization and genetic damage”. Financiado por la Fundación Alexander von Humboldt (AvH, Alemania). Responsable: Gustavo A. Folle. Investigador SECIF: F. Santiñaque.

2011-13     “Expresión génica diferencial durante la meiosis: identificación y caracterización de productos específicos de la profase meiótica masculina en roedores”. Financiado por CSIC I+D (UDELAR). Responsable: Adriana Geisinger. Investigadores del SECIF: F. Santiñaque, B. López-Carro y G. Folle.

2013-15     “Genómica de la reproducción: Estudio del transcriptoma durante el desarrollo de la línea germinal masculina mediante citometría de flujo, secuenciación masiva y bioinformática”. Proyecto Fondo Clemente Estable (ANII),  modalidad I. Responsable: Adriana Geisinger. Investigadores del SECIF: F. Santiñaque y G. Folle.

2016-18     “Rol de los ARNs no codificantes largos en la espermatogénesis”. Proyecto Fondo Clemente Estable (ANII), modalidad I. Responsable: Adriana Geisinger. Investigadores del SECIF: F. Santiñaque y G. Folle.

2017-20     “Estudio de la etiología y mecanismos de un tipo de infertilidad humana vinculada a mutaciones en genes para proteínas del complejo sinaptonémico”. Proyecto Fondo Clemente Estable (ANII), modalidad II. Responsable: Rosana Rodríguez-Casuriaga. Investigadores del SECIF: F. Santiñaque y G. Folle.

 

Colaboraciones internacionales

2008-           "Estudios citogenéticos en Solanum subgen. Leptostemonum (Solaneaceae)"
                     Tesis de Doctorado de Franco Chiarini, Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal, Museo Botánico de Córdoba, CONICET-UNC (Argentina).
Investigadores del SECIF: Beatriz López-Carro, Federico Santiñaque y Gustavo A. Folle.  

 

Servicios

 

Laboratorios Clausen

2005-08      “Determinación de reticulocitos en sangre de ratones tratados con eritropoietina mediante Citometría de Flujo”
Responsable por Laboratorios Clausen: Alejandro Ricciardi y Leticia Zarantonell (ver Apéndice 2).
Investigadores del SECIF: Valentina Porro y Beatriz López-Carro

 

HIV

2002-08      Determinación de poblaciones linfocitarias CD4, CD8 y CD3 en inmunodeficiencias adquiridas para instituciones médicas. Investigadores del SECIF: Beatriz López-Carro, Gustavo A. Folle y Federico Santiñaque.

 

INASE

2007-     Cuantificación de porcentaje de poliploidía en lotes de semillas de raigrás. Responsables por INASE: Jorge Machado y Deneb Manfrini. Investigadores del SECIF: Federico Santiñaque, Beatriz López-Carro y Gustavo A. Folle.

 

 

Formación de Recursos Humanos

Cursos internacionales

2003          Curso Internacional de Postgrado ICRO/EMBO/PEDECIBA/IIBCE: "Modern Approaches on the Principles and Applications of Cell Sorting and Flow Cytometry". IIBCE, Mayo 14-24. Organizador: SECIF

2005          Colaboración en conferencias y demostraciones de laboratorio sobre Citometría de Flujo en el Curso Internacional de Postgrado EMBO/PEDECIBA/IIBCE: "Calcium Signalling, with special attention to Cell Motility and the Cytoskeleton". Octubre 17-28, IIBCE.

2006          Curso Internacional de Postgrado AMSUD Pasteur/PEDECIBA: "Flow Cytometry and Cell Sorting: Basic and Applied Aspects". IIBCE e IPMONT, Diciembre 4-15. Organizador: SECIF.

2007          Colaboración en demostraciones de laboratorio sobre estudio del contenido de ADN y la viabilidad celular por Citometría de Flujo en el Curso de Postgrado EMBO/PEDECIBA/IIBCE: "First International School of BioChemistry. Molecular and Cell Biology on Calcium and the Cytoskeleton". Octubre 29 - Noviembre 1º.

2008-09    Curso Teórico-Práctico: "Curso Básico de Citometría de Flujo" Coordinador: G. Folle. Grupo Rioplatense de Citometría de Flujo (GRCF), Buenos Aires, Argentina                     

2008          Curso Teórico-Práctico (PEDECIBA-Biología): "Herramientas para el estudio de tramas tróficas microbianas". Coordinadora: Claudia Piccini, Departamento de Microbiología (IIBCE). Demostraciones de citometría de flujo aplicada a microbiología en SECIF. Diciembre 1-10, IIBCE.

2010          Curso Teórico-Práctico "Curso Básico de Citometría de Flujo" . Conferencista Invitado: Gustavo A. Folle. Facultad de Medicina (UBA), Buenos Aires (Argentina). Noviembre 1-5, Grupo Rioplatense de Citometría de Flujo (GRCF).

2012          Curso Teórico-Práctico: “Citometría de Flujo”. Docente invitado: Gustavo A. Folle. Universidad de Bahía Blanca, Argentina, Marzo 26-30.

2012          Curso Teórico-Práctico: “Curso Básico de Citometría de Flujo”. Docente invitado: Gustavo A. Folle. Grupo Rioplatense de Citometría de Flujo (GRCF). Colegio Oficial de Farmacéuticos y Bioquímicos, Buenos Aires, Argentina, Agosto 27-31.

2014          Curso Teórico-Práctico (PEDECIBA-Biología): “Citometría de Flujo y Separación Celular en Biotecnología y Biomedicina”. Docente invitado: Gustavo A. Folle. Práctico sobre “Análisis de ADN” con la colaboración de Beatriz López-Carro. por Citometría de Flujo en el Curso Postgrado IPMONT-IIBCE. Gustavo Folle,.

2015          Curso Teórico-Práctico: “Citometría de Flujo”. Docente invitado: Gustavo A. Folle. Universidad de Bahía Blanca, Argentina, Marzo 26-30.

2016          Curso Teórico-Práctico (PEDECIBA-Biología): “Curso Básico de Citometría de Flujo y sus Aplicaciones en Investigación". Conferencista invitado: Gustavo A. Folle. Febrero 22-26, Instituto Pasteur de Montevideo.

2018          Curso Internacional de Posgrado “Advanced Applications of Flow Cytometry on the Study of Biological Systems”. Conferencista Invitado: Gustavo A. Folle. Marzo 5-8, CONICET, La Plata, Argentina.

2018          Primera Escuela Latinoamericana de Citometría de Flujo. Conferencista Invitado: Gustavo A. Folle. Prácticos de Clasificación Celular: Federico Santiñaque. Octubre 1-5, Instituto Pasteur de Montevideo e IIBCE.

Cursos nacionales

2002-          Curso Anual de Postgrado (PEDECIBA) sobre Cultivo de Células con entrenamiento teórico-práctico en Citometría de Flujo y Clasificación Celular.
2002-          Curso Anual de Postgrado (PEDECIBA) sobre Daño y Reparación del ADN con entrenamiento teórico-práctico en Citometría de Flujo de viabilidad, daño genético y muerte celular.

Actividades de divulgación

2002-          Participación del equipo del SECIF en las actividades de visitas escolares y liceales, IIBCE Abierto y, a partir de 2006, en la Semana de la Ciencia y la Tecnología.

Pasantías y Entrenamientos

2004           Mariana Slabogorski (Tesis de Grado, Facultad de Ciencias)
2005           Magdalena Vaio (Tesis de Maestría, Facultad de Agronomía)
2006           Pablo Liddle (Tesis de Grado, Facultad de Ciencias)
2007           Federico Santiñaque (Facultad de Ciencias)
2009           Rosana Rodríguez Casuriaga (Dosctorado, PEDECIBA, Biología)
2010           Franco Chiarini (Museo Botánico de Córdoba, CONICET-UNC, Argentina).
2014           Karen Bauk (Museo Botánico de Córdoba, CONICET-UNC, Argentina).
2013-14     Gianni Curti (Tesis de Maestría, PEDECIBA, Biología)
2014           Andrés Goldman (Tesis de Maestría, PEDECIBA, Biología)
2014           Analía Sanguinetti (Tesis de Maestría, PEDECIBA, Biología)
2015           Elisa Souza Sadetzki (Tesis de Maestría, PEDECIBA, Biología)
2015           María Fernanda Trovero (Tesis de Doctorado, PEDECIBA, Biología)

 

Convenios

2006-          Convenio de Plataforma Conjunta con el Instituto Pasteur de Montevideo en Citometría de Flujo y Clasificación Celular.

 

Equipamiento:

 

El equipo corresponde a un citómetro de flujo y clasificador de última generación MoFlo Astrios EQ (Beckman Coulter) adquirido con fondos de la Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) y de IIBCE con apoyo adicional de PEDECIBA. Presenta como característica saliente la detección simultánea de partículas con amplio rango dinámico (0,2 a 30 micras) lo que permitirá desarrollar nuevas áreas de aplicación de la citometría de flujo (CF) en investigaciones tanto a nivel básico como aplicado. El equipo posee las siguientes características técnicas:

Óptica

El instrumento está equipado actualmente con 2 LASER (488 nm 7 635 nm) con la siguiente configuración óptica:

LASER 488 (filtros de banda y ejemplos de fluorocromos detectables)

488/6              Dispersión fronatl (FSC1 y FSC2)
488/6              Dispersión lateral (SSC)
513/26           FITC (FluoresceÍna)
576/21           PE (Ficoeritrina)
620/29           PE-TR (Ficoeritrina-Texas Red)
664/22           PE-Cy5 (Ficoeritrina-Cianina 5)
710/45           PE-Cy5.5 (Ficoeritrina-Cianina 5.5)
795/70           PE-Cy7 (Ficoeritrina-Cianina 7)

LASER 640 nm

671/30           APC (Aloficocianina)
722/44           Alexa 700
795/70           (Aloficocianina-Cianina 7)

Total: 12 parámetros de detección

En su configuración máxima el citómetro Astrios EQ puede albergar 7 LASER y detectar 32 parámetros en forma simultánea

El haz (beam) del laser en la columna líquida es de tipo Flat top a nivel horizontal y gaussiana a nivel vertical proporcionando mayor estabilidad lumínica y facilitando la alineación. El citómetro solicitado puede albergar hasta 7 laser (7 pinholes) lo que permite ampliar considerablemente las prestaciones multiparamétricas del equipo en el futuro.

Fluídica

En relación a la dinámica de fluidos, el equipo posee un compresor adecuado para manejo de presiones de líquido de vaina y de la muestra en un amplio rango (4-90 psi) con manejo combinado (manual/software) de los niveles de presión empleando boquillas de 70 y 100 micras. Además, posee un sistema automático para agitación periódica de la muestra a fin de mantener homogéneas las suspensiones biológicas durante los procesos de análisis o clasificación. El instrumento presenta una elevada estabilidad del enfoque hidrodinámico y permite seleccionar el nivel óptimo de presión de los fluidos para maximizar la viabilidad de la muestra en las clasificaciones. También es posible acomodar tubos de diferente volumen (0,5 - 50 mL) como recipiente para la muestra aparte del estándar (5 mL) lo que le confiere una gran versatilidad en el manejo de muestras sin previa concentración.

Detección y análisis
           
Los fotomultiplicadores (PMTs) tienen capacidad de detección entre 185 a 900 nm (rango dinámico:10e5). Es el único citómetro en el medio que posee electrónica (procesamiento de señales) de 32 bits y su correspondiente software (Summit v6.2) lo que permite un análisis ultrarrápido de los datos adquiridos. La tasa de adquisición de datos es superior a los 100.000 eventos por segundo. El instrumento alcanza una linearidad de 2.00 ± 0.05 y provee un constante y detallado control de calidad (QC) del funcionamiento del equipo durante las determinaciones.

Sensibilidad

La sensibilidad de fluorescencia determinada mediante el empleo del laser 488 nm y Spherotech 8-peak beads es de menor a 125 MESF (Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome) para FITC y menor a 110 MESF para PE.

Clasificación y deposición

El equipo es capaz de clasificar con muy alto grado de pureza (> 99%) células, microorganismos, elementos subcelulares e incluso biomoléculas complejas a una tasa de 70.000 eventos por segundo. Posee 6 vías de clasificación con la posibilidad de desarrollar en simultáneo clasificaciones en diferentes modos (enrich, purify, single). Posee un dispositivo sencillo y efectivo para la determinación y el monitoreo del punto de ruptura (Drop delay) de la columna líquida (IntelliSort), parámetro altamente crítico para asegurar el nivel de pureza en las clasificaciones. Por otra parte, trae incorporado un sistema de bloqueo rápido (SortRescue) en caso de existir alteraciones durante el desarrollo de la clasificación celular lo que protege la pureza de los eventos ya clasificados.

El citómetro Astrios EQ provee una amplia gama de posibles sustratos para la deposición de las células o partículas incluyendo tubos de diferente volumen, mutipocillos de 6, 12, 24, 96 y 384 hoyos y portaobjetos con el dispositivo Cyclone. Es el único citómetro capaz de depositar células o partículas en multipocillos de 1536 hoyos. El equipo viene provisto de un efectivo sistema de contención y evacuación de aerosoles para protección del operador y del ambiente. Asimismo, cuenta con un eficiente sistema de regulación de la temperatura (± 0.2 ºC) para la muestra y los recipientes de clasificación.

Módulo EQ o Enhanced Forward Scatter (eFSC)

La capacidad analítica diferencial del Astrios EQ proviene del reciente desarrollo de la tecnología denominada “enhanced Forward SCatter”(eFSC) o desviación frontal potenciada. El eFSC consiste en dos canales de FSC independientes (FSC-1 y FSC-2) con selección de 7 máscaras diferentes sumado a un set de filtros neutrales ABS  (0.3, 0.6, 1.0, 1.3, 2.0 OD) para variadas aplicaciones. Además, la resolución del equipo es máxima ya que puede operar con niveles de umbral (triggering threshold) del 0.001%. Esta particular configuración torna posible el análisis y la separación en flujo una gran variedad de muestras de diferente origen (biológicas, ambientales, alimenticias, clínicas, etc.)

Para alcanzar esta capacidad única de detección, el equipo viene provisto de un conjunto de filtros necesarios para evitar el ingreso al sistema de fluidos de pequeñas partículas contaminantes no pertenecientes a la muestra y que generen background que puede interferir con las mediciones. El sistema de filtración incluye filtros de aire en serie de 0,01 µm y para el líquido de de vaina de 0,04 µm.

Análisis

El SECIF cuenta con el software Kaluza para el análisis pormenorizado de los resultados de los estudios citométricos

 

Cámara de Flujo Laminar de Bioseguridad
(Cytogarde, FluFrance)
Permite la manipulación estéril de las muestras a analizar con completa protección del operador (muestras de riesgo biológico)

 

Equipo MediMachine (Dako-Cytomation)

Instrumento de alta eficiencia para la disgregación de tejidos frescos, fijados o incluidos en tacos de parafina para su posterior análisis citométrico.

Contactos:

 

Dr. Gustavo Folle

Mail: gfolle@iibce.edu.uy ; gustavofolle@gmail.com

 

Mag. Federico Santiñaque

Mail: fsantinaque@iibce.edu.uy ; federico.santinaque@gmail.com

 

Teléfono: (598) 24871616 int. 136 ó 218.